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背景
N6-甲基腺苷(m6A)修饰在对应力的动态响应中起重要作用。招募m6A写入剂METTL3-METTL14甲基转移酶复合物(MTC)产生m6A。除了核心亚单位METTL3和MEYYL14之外，Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)还与METTL3-METTL14结合，并且是METTL3-METTL14核心复合物的核定位所必需的。m6A改造通常与MTC的招募相结合。例如，m6A介导的热休克基因的RNA降解是由METTL3定位于这些基因loci4介导的。此外，紫外线诱导的DNA损伤位点m6A修饰的RNA增加与METTL3和METTL14的募集相关。此外，m6A在人多能干细胞中的协同转录是通过METTL3-METTL14和转录因子SMAD2/3之间的相互作用介导的。同样，m6A修饰的急性髓性白血病中转录因子CEBPZ靶基因也是通过METTL3和CEBPZ7之间的相互作用实现的。赖氨酸36三甲基化组蛋白H3(H3K36me3)标记的染色质的m6A转录物修饰与METTL14和H3K36me3之间的相互作用有关。最后，METTL3在染色体相关调控RNA(carRNAs)上沉积m6A修饰，如启动子相关RNA和增强子RNA，以调控染色质状态和转录。然而，METTL3-METTL14与这些特定染色质位点的关联不可避免地与其m6A甲基转移酶活性相关，这导致m6A安装在其靶转录物上。值得注意的是，对METTL3-METTL14复合物的m6A非依赖性功能仍知之甚少。
简介
年4月，来自美国威斯达研究所的RugangZhang及其团队在NatCellBiol(IF:20.)杂志上发表名为m6A-independentgenome-wideMETTL3andMETTL14redistributiondrivesthesenescence-associatedsecretoryphenotype的研究[1]。
主要结果
METTL3和METTL14调控SASP。我们通过敲除原代胚胎肺成纤维细胞(IMR90细胞)中MTC核心亚基METTL14的表达，以探索MTC在衰老中的作用(图1a)。为了限制潜在的脱靶效应和确定m6A依赖性变化，我们在METTL14敲除细胞中通过表达野生型METTL14或在介导RNAm6A修饰缺陷的RP突变METTL14进行了拯救实验。我们在这些细胞中进行RNA测序(RNA-seq)分析，以比较和对比METLL14依赖性和m6A依赖性基因表达变化。结果显示，野生型METTL14挽救的METTL14依赖性基因表达变化中，有93%也被RP突变体挽救(图1b，c)。这一结果表明，绝大多数METTL14依赖性基因表达变化是m6A非依赖性的。
图1.METTL3和METTL14调控SASP
SASP不受m6A的调控。研究结果表明，SASP基因的上调依赖于METTL3和METTL14，但不依赖于m6A。为了直接检测这种可能性，我们通过RNA免疫沉淀，绘制了m6A在控制细胞和衰老细胞在转录组水平的分布，随后进行了测序。衰老过程中，m6A在转录组水平上的分布没有显著性变化。值得注意的是，由METTL3-METTL14调控的SASP基因不受m6A调控，如分析中的背景信号所示(图2a)。接下来，我们试图通过用野生型或突变型METTL3或METTL14在衰老细胞中敲除内源性METTL3或METTL14(有或无拯救)来验证这一发现。通过METTL3或METTL14敲除，确实降低了m6A的水平，这可以通过野生型而不是突变体METTL3或METTL14拯救(图2b)。此外，我们验证了SASP基因的mRNA没有受到m6A修饰，这可从RNA免疫沉淀分析中抗m6A抗体与对照IgG之间的水平相当得到证明(图2c)。相反，作为阳性对照，PHLPP2mRNA22上的m6A修饰因内源性METTL3或METTL14敲除而减少，这是通过野生型而不是突变体METTL3或METTL14挽救的(图2d)。考虑到carRNAs上m6A修饰在调控转录中的作用，我们分析了衰老细胞中敲除或不敲除METTL3或METTL14的carRNAs。
图2.SASP不受m6A调控
全基因组METTL3和METTL14再分布。接下来，我们在对照组和衰老细胞中使用剪切-运行法，通过绘制METTL3和METTL14与染色质的关联图以确定MTC调控SASP的机制。在对照组细胞中，两种蛋白显示出压倒性的共定位(图3ac)。相反，METTL3和METTL14均在衰老细胞中重新分布，但模式不同(图3ac)。具体而言，METTL3在上游靠近基因转录起始位点(TSS)的结合增加，而METTL14显示在距离基因体至少10kb处结合增加(图3d)。鉴于METTL3-METTL14复合物的再分布模式及其在调控SASP中的作用，我们接下来通过RNA聚合酶II(PolII)染色质免疫沉淀(ChIP)测序(ChIP-seq)直接探索METTL3和METTL14在衰老过程中基因转录中的作用。有趣的是，尽管METTL3或METTL14的敲除不影响全局PolII分布，但PolII与SASP基因座的关联因其敲除而降低(图3e)。这与敲除METTL14或METTL3抑制SASP基因表达的研究结果一致(图1)。
图3.对METTL3和METTL14的全基因组再分布
METTL3和METTL14是SASP促肿瘤功能所必需的。SASP因子在癌症中起着环境依赖的作用。例如，SASP在免疫缺陷小鼠的体外和体内中均可促进肿瘤细胞的生长。为了进一步确定MTC调控的SASP在生理学背景下的作用，我们用从衰老细胞中收集的条件培养基处理卵巢癌细胞，敲除或不敲除MTC的METTL、METTL3或WTAP亚基。来自衰老细胞的条件培养基的促生长作用通过敲除MTC的所有三个亚基而显著性降低(图7a)。与此一致的是，在异种移植物模型中，通过体内敲除所有三种MTC亚基，共同注射的衰老成纤维细胞的肿瘤生长刺激效应显著性受损(图7b，c)。
图7.METTL3和METTL14是SASP的促肿瘤和免疫监视功能所必需的
结论及展望
我们的研究建立了一个独立于m6A的METTL3-METTL14复合物的函数。METTL3向SASP基因启动子和METTL14向增强子的再分布表明，METTL3-METTL14复合物在调控转录中起重要作用，与其m6A功能无关。值得注意的是，由METTL3和METTL14调控的SASP基因主要是NF-κB靶基因，这与我们的研究结果一致，即METTL3和METTL14与NF-κB相互作用以调节其活性。尽管SASP对于免疫监测和清除癌基因激活诱导的恶性前期病变中的衰老细胞至关重要，但它通过促进肿瘤生长对已形成的肿瘤有害。因此，我们的发现与新出现的证据一致，即MTC亚基如METTL3和METTL14主要在癌症中发挥致癌作用。此外，独立于METTL14，METTL3与EIF3相互作用以调控mRNA的链(包括具有m6A修饰的mRNA)，从而控制肿瘤发生过程中的mRNA翻译。总之，这些发现表明，与靶向MTC复合物的m6A甲基转移酶活性相比，降解MTC复合物的亚基可能是有利的，因为它将同时抑制MTC的m6A依赖性和非依赖性功能。本研究的一个局限是集中于衰老过程中SASP背景下METTL3和METTL14的m6A非依赖性转录调控功能。然而，我们设想METTL3和METTL14的m6A非依赖性和转录调控功能可能参与许多超出我们当前研究的生物学过程。
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