年9月美国剑桥布罗德学院StuartL.Schreiber于Nature上发表文章Plasticityofetherlipidspromotesferroptosissusceptibilityandevasion其研究揭示了过氧化物酶体醚-磷脂轴在驱动对铁作用的敏感性和逃避方面的作用，强调了PUFA-ePL作为一种独特的功能性脂类，在细胞状态转变过程中受到动态调节，并提出了在涉及铁作用的疾病的治疗干预中存在多个调节节点。
图1：全基因组CRISPR筛选发现过氧化物酶体成分对铁死亡易感性有贡献。
铁死亡敏感性动态调节的分子和代谢基础尚不清楚。为了识别调节铁蛋白作用易感性的因素，作者在铁蛋白易感的透明细胞肾细胞癌(ccRCC)模型-O3和高级别卵巢浆性卵巢癌模型OVCAR-8中进行了两次独立的全基因组CRISPRCas9抑制基因筛选(图1a)。在这两种模型,铁死亡诱导是通过抑制脂质过氧化的修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)使用ML或1s,3r-rsl3(RSL3)而实现的。因为过氧化物酶体以前并不涉及fERroptotic细胞死亡,作者专注于阐明他们在这一过程中可能的作用。其发现消耗基因编码PEX3PEX10和PEX12OVCAR-8和-o细胞使用CRISPRCas9减少大量的过氧化物酶体和减少细胞的敏感性铁死亡。相反,实验老鼠PEX3过度或PEX10互补对失活的相应的人类single-guiderna(sgRNAs)恢复灵敏度铁死亡,支持过氧化物酶体作为肾和卵巢癌细胞铁蛋白易感性的贡献者的作用。在其它生化功能中，过氧化物酶体可以解毒胞内活性氧，并启动极长链和支链脂肪酸的降解。此外，过氧化物酶体参与醚联甘油脂的生物合成，与酯联甘油脂不同(R1CH2CO2CH2R2)。
图2：多不饱和醚脂类生物合成途径介导过氧化物酶体的亲铁化作用
在甘油sn-1位置具有醚键(图2a)。醚磷脂包括两种亚型:1-o-烷基甘油磷脂;和1-O-烯-甘油磷脂，称为缩醛磷脂。大多数质原在sn-2位置处具有酯链连接的多不饱和脂肪酸酰基(PUFA)链(图2a)。与过氧化物酶体的脂质合成功能一致的是，脂质谱显示PEX3-和pex10耗尽的细胞中都选择性地丢失了醚甘油脂;减少对不饱和酯是最突出的磷脂(PUFA-ePLs),这主要是缩醛磷脂可能(图2b)。因为agp和FAR1两过氧物酶体相关酶催化醚脂类的生物合成也成为点击率最高的CRISPR,作者建议醚脂类的生物合成可能pro-fERroptotic过氧化物酶体的功能的一部分。事实上,CRISPRCas9-介导的agp或枯竭FAR1基因,进行散装数量或派生的单细胞克隆,重现了铁死亡抑制表型和随之而来的醚磷脂的变化,观察过氧物酶体损耗(图2cg)。的特异性CRISPRCas9淘汰赛过程验证了通过引入这些表型逆转sgRNA-抑制agp或Far1互补到这些细胞。pro-fERroptotic角色的醚脂生物合成途径进一步证实了超表达野生型细胞异位的互补的短发卡RNA(成分)介导的基因可拆卸的,AGPS13和小分子抑制剂的使用。相比之下,两个无关醚脂质代谢酶酶超氧化物歧化酶1(由SOD1编码)和过氧化氢酶(CAT)编码不改变细胞的敏感性铁死亡，符合pro-fERroptotic角色的过氧化物酶体专门由醚脂类的生物合成。这些分析表明，醚脂生物合成途径的亲铁化作用可能适用于其他类型的癌细胞和人类癌症。值得注意的是，在过氧异构耗尽的细胞中，醚磷脂的损失发生时，ACSL4或溶血磷脂酰转移酶3(LPCAT3)在大多数细胞多不饱和脂的生物合成中限制速度的酶的水平没有显著变化。共同敲低ACSL4以及过氧物酶体和醚类脂生物合成基因导致进一步保护铁死亡类似铁死亡抑制剂fERrostatin-1赋予的效果(FER-1)。这些观察结果表明non-pERoxisome来源的PUFA铁死亡脂质指向一个潜在的组合战略,包括抑制ACSL4和PUFA-ePL阻止铁死亡生物合成的酶。
醚脂的生物合成是通过过氧化物酶体与内质网(ER)的功能协作实现的。在过氧化物酶体中，FAR1,GNPAT和AGPS作用合成醚脂前体1-o-烷基甘油-3-磷酸(AGP)。然后AGP被发送到ER，在那里它在甘油的sn-2位置酰基化，在sn-3位置加上头基团，对于质脂原，通过脱氢产生一个双键，形成一个烯丙基醚连接。虽然在sn-2位置添加PUFA对合成铁铁相关醚类脂质至关重要，但尚不清楚是哪一种内质网酶介导了这一过程。作者鉴定了ER定位酶1-酰基甘油-3-磷酸o-酰基转移酶3(由AGPAT3编码)在两个CRISPR筛选中都是一个hit(图1b)。在人类单倍体KBM7细胞的CRISPR筛选中，AGPAT3也是一个亲铁死亡的hit。值得注意的是，AGPAT3已被报道选择性地将花生四烯酸或二十二碳六烯酸与溶血磷脂酸结合，从而合成二酰基磷脂酸。然而，AGPAT3是否也有助于AGP酰化和PUFA-ePL的生物合成尚不清楚。因为这个原因作者进行脂质分析显示消耗的AGPAT3选择性降低的水平多不饱和种类乙醚基和二酰基磷脂(图2h),符合上述基因损耗AGPAT3抑制敏感铁死亡(图2)。这些结果表明,Agpat3下游功能的酶途径合成PUFA-ePLsER。
为了证实PUFA-ePLs在诱导对铁死亡的敏感性方面是必要的和充分的，作者制定了各种各样的二酰基和醚磷脂作为脂质体纳米颗粒用于给细胞递送(扩展数据图8b)。在含有乙醇胺的磷脂中，使用C18-c20:4pe、C18-c22:6pe或C18-c20:4pe而不使用C18-c18:1pe均可导致OVCAR-8细胞的铁死亡增感。在含胆碱的磷脂中，C18-C20:4PC具有显着的铁死亡敏化活性，而C18-C18:1PC不具有显着的铁死亡敏化活性，C18-0-C20:4PC具有显着的铁死亡敏化活性。类似的效果观察PEX3,PEX10——或者AGPS-敲低OVCAR-8和-o细胞。在一起,这些结果表明,PUFA链的存在但不是烯丙基醚组铁死亡敏化是至关重要的。
为了排除摄取后应用PUFA-ePLs向其他磷脂的细胞内转化可能是其增强细胞对铁蛋白作用敏感的可能，作者使用了脂质纳米颗粒后立即对gpx4抑制细胞BODIPY-C11氧化的时移成像来评估脂质过氧化水平。这一分析表明,C18:0-C20:4PE和C18(质)-C20:4PE诱导脂质过氧化反应迅速增加,而使用C18(质)-C20:4PC诱导过氧化水平略高于C18:0-C20:4PC。这些数据表明,PUFA-plasmalogens确实在GPX4-inhibited细胞氧化。PUFA-ePE和PUFA-ePCePE，醚连接的磷脂酰乙醇胺;ePC,ethER-linked磷脂酰胆碱在细胞水平处理ML甚至时间短90分钟治疗让细胞在一个可行的状态即使他们经验增加脂质引起的磷脂水解和脂质过氧化。
图3：最初依赖GPX4的癌细胞通过下调PUFA-ePLs来逃避铁死亡
作者接下来评估过氧化物酶体中是否同样促进敏感铁死亡。由于缺乏适合体内使用的GPX4抑制剂，作者生成了GPX4/OVCAR-8和-O细胞，这些细胞依赖于铁死亡抑制剂fe-1来维持其活性。与GPX4/表达非靶向阴性对照sgRNAs(sgNC)的细胞相比，GPX4/表达PEX3、PEX10、AGPS或FAR1缺失的细胞在体外表现出了更高的生存能力(图3a)。当植入免疫缺陷小鼠体内时，GPX4+/+细胞迅速形成肿瘤，而GPX4/-sgNC细胞的肿瘤形成明显延迟，表面上是因为这些细胞在体内经历了铁死亡;然而，在第6周，同时缺失GPX4和AGPS、FAR1、PEX3或PEX10的细胞比GPX4/-sgNC细胞形成更大的肿瘤(图3b)。这些结果表明，过氧化物酶体醚-脂轴在体内和体外都有助于铁亡敏感性。值得注意的是,作者的数据表明,agp-FAR1,PEX3——或者AGPAT3-depleted癌症细胞可以在体外和体内强劲增长(图3a,b)。这些结果表明,醚磷脂在肾和卵巢癌的增长中是可有可无的,虽然他们的浓缩授予铁死亡的脆弱性
作者还研究了癌细胞是否能够进化策略，以逃避实验诱导的铁死亡。作者观察到，在OVCAR-8和-O肿瘤异种移植中，易受铁运损伤的GPX4/细胞最初似乎无法定植小鼠;然而，在潜潜期后出现了大的肿瘤结节(图3b,c)。作者成功地从-O肿瘤中分离出癌细胞，并证实这些细胞仍然没有gpx4(图3d)。将这些明显抗运铁蛋白(FR1)细胞重新植入小鼠体内，可导致肿瘤快速生长，且无明显的潜伏期(图3e)，这意味着FR1细胞获得了一种或多种细胞遗传特性，使其对GPX4缺失不敏感。为了探究体内观察到的逃避铁蛋白作用的机制，作者对GPX4/FR1细胞(称为FR2细胞)形成的肿瘤中分离出来的细胞进行了代谢组学和脂质体组学分析。发现PUFA-ePLsFR2最显著下调脂质细胞相对于水平细胞从父母的准备,铁死亡易感肿瘤(图3fh)。这些结果表明,ccRCC细胞可以调节PUFA-ePL水平,这种生化可塑性可能促进体内避免铁死亡过程。
图4：在分化过程中，
神经元和心肌细胞PUFA-ePLs增加，并对铁死亡敏感
接下来，作者评估了ccRCC细胞中PUFA-ePLs的下调是否可能是由缺陷过氧化物酶体的生物发生所驱动的。与亲本肿瘤细胞相比，作者发现FR2细胞中过氧化物酶体丰度没有重大变化。此外，外显子组测序显示FR2细胞中只有一种非同义体细胞突变:TLR7小移码删除,这不是在作者CRISPR和没有报道铁死亡相关功能。然而,RNA序列显示,在87个已知的过氧物酶体和醚脂生物合成基因,agp和TMEM(也称为PEDS1)显著下调FR2细胞减少验证蛋白质水平(图3i,j)。其他已知的铁死亡调控基因的表达水平包括ACSL4LPCAT3和AIFM2(编码FSP1)没有显著改变。TMEM编码1-O-alkyl-PEdesaturase1-O-alkyl醚转换成1-O-alkenylethERs,并显示与ACSL4之间的互相依存,PEX3和FAR1癌症依赖map25。然而，TMEM在作者的CRISPR上并不是一个大热门。此外，使用CRISPRCas9、shRNA或cDNA扰动TMEM水平并没有显著改变被测细胞系对铁死亡的敏感性，这表明PUFA-ePLs的亲铁化作用不依赖于键中的双键。相比之下，作者发现AGPS失活减少了1-o-烷基脂和1-o-alkenyl-脂足以恢复GPX4/肿瘤的生长。这表明，在ccRCC模型中，AGPS的自发下调而不是TMEM导致了所观察到的铁死亡抗性的出现。然后，作者研究了PUFA-ePLs的铁铁致敏作用是否与非肿瘤性环境相关。作者选择了神经元和心肌细胞作为来自大脑和心脏的主要细胞类型，这两个重要器官分别表现出高ePL水平，并有报道称在某些病理条件下会发生铁蛋白作用。作者发现分化神经元表现出更高的灵敏度GPX4-inhibition-induced比亲代细胞脂质过氧化和铁死亡,不同与调节PUFA-ePEs和PUFA-ePCs相关的神经元(图4cf)。
作者还发现,心肌细胞来源于人类诱导多能干细胞(iPS细胞)更为敏感GPX4抑制比心脏祖细胞来源于iPS细胞(图4d）作者的脂质学分析进一步显示心肌细胞与心脏祖细胞相比显著上调PUFA-ePEs和PUFA-ePCs(图4e)。此外，PEX3或AGPS的下调降低了心肌细胞对铁死亡的敏感性(图4f)，提示PUFA-ePL上调有助于增强心肌细胞对铁死亡的敏感性。总之，PUFA-ePLs的选择性上调与神经系和心脏系的铁铁易感状态相关(图4g)。作者在此描述过氧化物酶体和PUFA-ePLs在调节癌症、神经和心脏状况中对铁蛋白依赖性的重要性。此外，通过下调ePL生物合成酶的表达，获得低pufa-ePL状态，可导致ccrcc携带者逃避铁死亡和肿瘤复发。尽管主要的PUFA-epl类型的质浆原由于其alkenyl-ethER基团的反应活性而被视为抗氧化剂，但作者的研究描述了一个额外的、亲铁化的作用，这是针对在sn-2位置有PUFA的ePLs特有的。鉴于从阿尔茨海默病患者的脑标本中发现浆原水平显著降低，进一步研究浆原介导的铁蛋白增多在神经退行性变中的作用是有必要的。作者还注意到，心肌细胞的铁蛋白作用已被报道有助于化疗缺血再灌注诱发的心肌病，而铁螯合剂dexrazoxane是唯一被美国食品和药物管理局批准用于治疗阿霉素诱导的心脏毒性的药物。这些不同的发现表明，铁中毒的诱导可能是一种强大的抗癌策略，而阻断铁中毒过程可能有助于预防或减轻对大脑和心脏的各种类型的损伤。
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